在抗生素與細(xì)菌長(zhǎng)達(dá) 70 余年的對(duì)抗中，日益嚴(yán)峻的抗菌素耐藥性問題正推動(dòng)科研走向縱深。最新研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌釋放的揮發(fā)性有機(jī)化合物（VOCs）——這些由代謝活動(dòng)生成的“分子指紋"，為精準(zhǔn)識(shí)別菌種、破解耐藥機(jī)制提供了關(guān)鍵線索！Longshorewell Institute 研究團(tuán)隊(duì)通過vAPCI-CMS 質(zhì)譜聯(lián)用方案，成功捕獲細(xì)菌代謝釋放的揮發(fā)性有機(jī)物（VOCs），僅需 24 小時(shí)即可 100% 區(qū)分大腸桿菌與金黃色葡萄球菌，2 小時(shí)即顯示部分區(qū)分能力！

技術(shù)亮點(diǎn)

快速檢測(cè)：僅需2分鐘完成樣本分析

高靈敏度：區(qū)分大腸桿菌（E.coli）與金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）

實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)：非破壞性采樣，支持長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，追蹤細(xì)菌生長(zhǎng)過程中的VOC變化

實(shí)驗(yàn)成果

24小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)100%靈敏度與特異性區(qū)分；

僅需2小時(shí)即可部分區(qū)分細(xì)菌種類；

通過代謝組學(xué)分析，揭示細(xì)菌生長(zhǎng)與VOC釋放的動(dòng)態(tài)關(guān)系。

實(shí)驗(yàn)方法

細(xì)菌平板制備流程

采用OD600值在0.2-0.5 AU（吸光度單位）的液體培養(yǎng)基菌液，制備細(xì)菌平板（見圖1）。所有接種平板均以一式三份制備，接種后置于37°C恒溫箱培養(yǎng)，確保數(shù)據(jù)可重復(fù)性。同步制備三組空白瓊脂平板，與接種平板共同培養(yǎng)，精準(zhǔn)排除培養(yǎng)基背景干擾。

圖 1：(A) 大腸桿菌培養(yǎng)的瓊脂平板；(B) 金黃色葡萄球菌培養(yǎng)的瓊脂平板；以及兩者同時(shí)生長(zhǎng)的平板。

vAPCI-MS細(xì)菌VOCs分析全流程

儀器配置：

     采用 AIS expression CMS 質(zhì)譜儀，搭載 vAPCI 離子源（圖2）

圖 2：vAPCI-CMS，用于采集揮發(fā)性有機(jī)化合物。

定制化平板采樣器（圖3）恒溫 37°C，與 100°C 加熱傳輸線直連。

圖 3：為 90mm 瓊脂平板設(shè)計(jì)的定制 VOC 采樣器，直接連接到 vAPCI

核心參數(shù)：

     離子源氣體溫度：350°C；

     毛細(xì)管溫度：250°C；

     傳輸線溫度：100°C；

     動(dòng)態(tài)采樣傳輸線流速：600 mL/min；

     質(zhì)荷比范圍：m/z 30-300；

     單次掃描時(shí)間：400毫秒；

     接種后2/6/24/48/72/96小時(shí)取樣，單次分析僅需2分鐘對(duì)大腸桿菌進(jìn)行24小時(shí)不間斷采樣，動(dòng)態(tài)捕捉VOCs代謝指紋演變。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

細(xì)菌VOCs的檢測(cè)

每個(gè)樣本通過 150 次質(zhì)譜掃描疊加，生成高信噪比特征光譜。圖 4 顯示了空白瓊脂板和接種 24 小時(shí)的大腸桿菌平板，差異峰直觀呈現(xiàn)菌株特異性代謝指紋。

圖 4：空白瓊脂平板（左）和接種 24 小時(shí)后的大腸桿菌平板的光譜

細(xì)菌VOC特征的區(qū)分

使用 SIMCA 軟件包（Umetrics，版本 14.1）進(jìn)行多變量分析。利用從 m/z 30 到 300 的每個(gè) m/z 響應(yīng)生成統(tǒng)計(jì)模型，分別使用偏最小二乘判別分析（PLS-DA）和主成分分析（PCA）。對(duì)空白、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在 2 至 96 小時(shí)的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的聚類進(jìn)行了評(píng)估。24 小時(shí)后空白組/大腸桿菌/金葡菌實(shí)現(xiàn) 100% 敏感度&特異性分離。在 2 小時(shí)時(shí)觀察到部分分離，金黃色葡萄球菌的靈敏度為 100%，特異性為 91.3%，而大腸桿菌的靈敏度為 87.5%，特異性為 73.9%（圖 5），提示代謝指紋在菌種潛伏期已具差異性！

圖 5：接種后 2 小時(shí)（左）和 48 小時(shí)（右）的空白瓊脂、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的 PCA 分析得分圖

細(xì)菌生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)追蹤

大腸桿菌是一種產(chǎn)生吲哚（m/z 118）的細(xì)菌，這是大腸桿菌光譜中的主要離子。通過在 24 小時(shí)內(nèi)監(jiān)測(cè) m/z 118 的變化，可以確定大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線（圖 6）

圖 6：連續(xù) 24 小時(shí)監(jiān)測(cè)吲哚（m/z 118）的大腸桿菌生長(zhǎng)曲線

多菌株同步檢測(cè)

基于多變量分析（MVA）篩選的特征標(biāo)記物，可以實(shí)現(xiàn)大腸桿菌（E.coli）與金黃色葡萄球菌（S.aureus）的同步精準(zhǔn)鑒別。圖7展示混合菌株的特征質(zhì)譜峰疊加圖譜。

圖 7：金黃色葡萄球菌（A）和單一平板上同時(shí)存在金黃色葡萄球菌和大腸桿菌（B）的譜圖

總結(jié)

基于 vAPCI 離子源與 AIS expression 質(zhì)譜儀的聯(lián)用技術(shù)，體外細(xì)菌培養(yǎng)物揮發(fā)性有機(jī)物（VOCs）檢測(cè)方案已通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。該技術(shù)具備以下核心優(yōu)勢(shì)：

非破壞性采樣

支持對(duì)細(xì)菌代謝特征的長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，避免樣本損耗，適用于連續(xù)培養(yǎng)研究

智能菌株鑒別

24小時(shí)實(shí)現(xiàn)菌株100%精準(zhǔn)區(qū)分（靈敏度與特異性雙達(dá)標(biāo)）;

2小時(shí)早期預(yù)警：部分菌株（如金黃色葡萄球菌）鑒別準(zhǔn)確率超91%