“clean meat"作為日益增長的全球人口的膳食蛋白質(zhì)替代來源，它的成功商業(yè)化將需要開發(fā)高效、廉價的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基。與基于血清的培養(yǎng)基相比，無血清培養(yǎng)基引發(fā)不同的細(xì)胞生長行為，但全面探索無血清培養(yǎng)對培養(yǎng)肉相關(guān)細(xì)胞類型的營養(yǎng)需求的影響的數(shù)據(jù)尚未報道。Edward N. O’Neill等人對在Essential 8無血清培養(yǎng)基和常規(guī)含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的C2C12細(xì)胞和培養(yǎng)基成分進(jìn)行了分析。

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實(shí)驗(yàn)前細(xì)胞的制備：

細(xì)胞：C2C12細(xì)胞；

培養(yǎng)基：40%的DMEM、40%的Ham’s F10、20%的FBS和另外的2.5ng/mL重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子；

培養(yǎng)方式：將細(xì)胞維持在組織培養(yǎng)物處理的（TC）聚苯乙烯培養(yǎng)皿上，以5000個細(xì)胞/cm²接種，并使用Try-pLE Express在達(dá)到約75%匯合時傳代。使用臺盼藍(lán)法通過血細(xì)胞儀進(jìn)行計數(shù)；

培養(yǎng)條件：37°C和5%CO₂。

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實(shí)驗(yàn)方法：

將TC處理的聚苯乙烯六孔板用Matrigel涂布，使用0.15mg/mL蛋白質(zhì)的稀釋溶液進(jìn)行常規(guī)薄涂布。將P10的C2C12細(xì)胞重懸于無血清Essential 8或PCGM培養(yǎng)基中，并以10⁵個細(xì)胞/孔接種，總體積為每孔3mL培養(yǎng)基。此后不久，將2μL Hoechst 33342核染色劑的濃縮儲備溶液加入每個孔中，使孔中的最終濃度為0.2μg/mL。細(xì)胞接種后，將6孔板不受干擾地留在細(xì)胞培養(yǎng)箱中。在觀察時間點(diǎn)，使用ImageXpress Pico高含量篩選顯微鏡系統(tǒng)對來自兩個培養(yǎng)基組的三個重復(fù)孔的協(xié)同反應(yīng)組進(jìn)行成像。

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檢測方法：

1.     葡萄糖、乳酸：HP 1100高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)與折射率（RI）檢測器結(jié)合使用Aminex HPX-87H柱。

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2.     氨基酸：使用REBEL分析儀（908 Devices）測量新鮮培養(yǎng)基和廢培養(yǎng)基中的氨基酸濃度。使用0.20μm無菌過濾器制備樣品以去除細(xì)胞碎片，然后使用REBEL稀釋劑稀釋。通過微流體毛細(xì)管電泳和高壓質(zhì)譜（CE-HPMS）對每個樣品進(jìn)行一式三份的分析。根據(jù)遷移時間和質(zhì)量自動識別分析物。

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3.     FGF2：使用人FGF2的酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒。使用SpectraMax iD3多模平板讀取器在450nm處讀取96孔測定板中的最終比色吸光度。

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實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1.     細(xì)胞密度：通過在培養(yǎng)過程中每24小時記錄一次每孔的細(xì)胞密度（圖1），確定與傳統(tǒng)含血清培養(yǎng)基相比，無血清E8培養(yǎng)基支持類似程度的細(xì)胞生長。E8細(xì)胞計數(shù)在第3天呈指數(shù)級增加，并更快地達(dá)到其最大值（高于PCGM培養(yǎng)基中的任何時間的細(xì)胞密度），但隨后開始輕微下降，然后在第6天后顯著下降（可能是由于細(xì)胞死亡和脫落增加）。PCGM細(xì)胞密度在第2天結(jié)束指數(shù)增長，但繼續(xù)逐漸增加到第7天。

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圖1 細(xì)胞密度的變化

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2.葡萄糖和乳酸濃度：數(shù)據(jù)（圖2A和2B）表明，葡萄糖在兩個培養(yǎng)基組之間的使用非常相似，直到第4天左右，盡管PCGM組中細(xì)胞持續(xù)生長，E8組中細(xì)胞數(shù)量減少，但PCGM的使用減慢，但E8的使用仍在繼續(xù)。雖然PCGM中的初始乳酸鹽濃度顯著高于E8，但在七天的培養(yǎng)期內(nèi)，兩種培養(yǎng)基中乳酸鹽積累的相對速率相似。

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3.FGF2的濃度：E8中的額外FGF2被用作旨在取代FBS功能的主要成分。數(shù)據(jù)（圖2C）表明，在培養(yǎng)的3或4天左右，兩種培養(yǎng)基中的FGF2濃度開始顯著降低，這大致是相應(yīng)細(xì)胞密度停止指數(shù)增長的時間。雖然在兩種培養(yǎng)基類型的培養(yǎng)中，FGF2濃度在約5或6天時達(dá)到其最小可測量值，但此后細(xì)胞密度維持了至少幾天?？傮w而言，兩種介質(zhì)類型之間的相對FGF2消耗模式?jīng)]有顯著差異。

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4.氨基酸濃度：（圖2E）PCGM和E8之間每種氨基酸的大多數(shù)初始（D0）濃度相似，與它們的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方一致。差異可能是由于PCGM中FBS成分的未知氨基酸圖譜造成的。對于任何一種培養(yǎng)基，許多氨基酸濃度都沒有隨著時間的推移而顯著降低，這表明它們沒有被使用或被細(xì)胞代謝循環(huán)。對于一些氨基酸，E8培養(yǎng)基組似乎消耗的與PCGM中的細(xì)胞相比更快。例如，與PCGM中的谷氨酰胺和甘氨酸濃度相比，在培養(yǎng)的第4–5天，E8中谷氨酰胺和甘氨酸的消耗量顯著增加。到第3天左右，E8中絲氨酸幾乎耗盡，這是指數(shù)生長停止的時間。除此之外，除了精氨酸等少數(shù)氨基酸外，大多數(shù)氨基酸的利用總體趨勢相似。

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圖2 葡萄糖、乳酸、FGF2、氨基酸濃度的變化

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實(shí)驗(yàn)結(jié)論：

結(jié)果表明，C2C12成肌細(xì)胞系在E8中的表現(xiàn)至少與含血清培養(yǎng)基同樣好（圖1）。C2C12是一種永生化肌肉細(xì)胞系，在重要生理方面與成人干細(xì)胞不同，成人干細(xì)胞可能與Clean Meat更相關(guān)。因而，為了達(dá)到更好的加工效率，Clean Meat行業(yè)可能需要開發(fā)自己的永生化細(xì)胞系，如C2C12。然而，來自不同物種和譜系的Clean Meat相關(guān)細(xì)胞的培養(yǎng)基需求之間存在顯著差異，針對每種細(xì)胞類型摸索、優(yōu)化培養(yǎng)基成分是必要的。

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該實(shí)驗(yàn)對葡萄糖和乳酸濃度動力學(xué)的檢查（圖2A和B）展示了培養(yǎng)基類型對細(xì)胞代謝行為的有趣影響。有血清和無血清培養(yǎng)基的葡萄糖利用率和乳酸積累基本相似，表明細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中的代謝活性沒有顯著差異，并表明無血清培養(yǎng)基可能不會直接影響葡萄糖代謝。然而，血清中存在的許多額外生長因子、細(xì)胞因子和其他信號分子中的一些的復(fù)雜相互作用可能也值得進(jìn)一步研究。

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氨基酸動力學(xué)分析（圖2E）表明，許多氨基酸不會被生長在含血清或無血清培養(yǎng)基中的細(xì)胞顯著消耗，因此可能不必包含在優(yōu)化的Clean Meat培養(yǎng)基中，或者至少不需要包含如此大量的氨基酸。然而，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也揭示了在兩種類型的培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞的氨基酸代謝之間的有趣差異。谷氨酰胺利用率的差異表明E8培養(yǎng)基中的細(xì)胞正在經(jīng)歷更高的谷氨酰胺裂解率，直到谷氨酰胺在第4天左右耗盡；E8中天冬氨酸和丙氨酸（谷氨酰胺分解的代謝產(chǎn)物）直到第4天的低消耗率支持了這一觀點(diǎn)。血清與無血清培養(yǎng)基之間氨基酸代謝的的生化差異很有趣，值得進(jìn)一步探索。

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雖然兩種培養(yǎng)基之間的總體FGF2利用趨勢沒有顯著差異。與PCGM相比，在無血清E8培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞更多地利用FGF2，這可能是由于缺乏血清中常見的其他生長促進(jìn)因子，使得FGF2作為SFM中生長的“底物"比其他情況下更重要。E8培養(yǎng)液中的FGF2越多，E8中獲得的總細(xì)胞數(shù)越高。然而，這種程度的增長是否決定了Clean Meat培養(yǎng)基中需要高水平的昂貴的生長因子仍然是一個懸而未決的問題。

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表征大多數(shù)Clean Meat相關(guān)細(xì)胞類型的代謝需求方面完成的工作相對較少，因此對它們做出的許多更具體的代謝假設(shè)都源于對這些細(xì)胞類型在早期研究中如何表現(xiàn)的了解，而這些研究通常都使用含血清的培養(yǎng)基。這些假設(shè)可能不利于將細(xì)胞轉(zhuǎn)化為無血清和化學(xué)定義的培養(yǎng)基的總體容易性和成功性。為各種細(xì)胞類型適當(dāng)優(yōu)化無血清培養(yǎng)基，以成本實(shí)現(xiàn)Clean Meat生物工藝，可能需要大量的時間和精力。也許，可以創(chuàng)建Clean Meat的細(xì)胞系，從而實(shí)現(xiàn)更大的多功能性，這可能是研究Clean Meat細(xì)胞/工藝的實(shí)驗(yàn)人員未來值得追求的目標(biāo)。

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