YIJI細(xì)胞培養(yǎng)液氧化應(yīng)激活性氧魯米諾化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

（中文版）

主要用途

YIJI細(xì)胞培養(yǎng)液氧化應(yīng)激活性氧（ROS）魯米諾化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)自由基探針

魯米諾和強(qiáng)化劑的參與下，細(xì)胞培養(yǎng)上清中的活性氧族使發(fā)光物氧化降解并發(fā)光，在化學(xué)發(fā)光儀

（Luminometer）的幫助下定量檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液活性氧族（過(guò)氧化氫）的生成和數(shù)量的而經(jīng)典的技術(shù)方

法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適用于各種動(dòng)物和人體細(xì)胞培養(yǎng)液的活性氧族的

檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)易，性能穩(wěn)定，檢測(cè)敏感。

技術(shù)背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH-）、過(guò)氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過(guò)氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過(guò)氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，甚而導(dǎo)致諸如男性不育、冠心病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。魯米諾（luminol），又稱(chēng)氨基鄰苯二甲酰肼（luminol;3-aminophthalic hydrazide 5-amino-2,3-dihvdro- 1,4-phthalazinedione），是一種脂溶性的發(fā)光劑，氧化后生成魯米諾自由基而化學(xué)發(fā)光，具有460nm左右峰值的帶狀光譜，肉眼可觀察到鮮明的紫藍(lán)色。魯米諾以單價(jià)氧化形式與超氧自由基陰離子反應(yīng)，產(chǎn)生不穩(wěn)定性?xún)?nèi)過(guò)氧化物或二氧環(huán)丁烷（Dioxetane），由此分解成電激發(fā)狀態(tài)，通過(guò)釋放光子，回復(fù)到基態(tài)。魯米諾作為探針，可以檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)外過(guò)氧化氫、超氧自由基陰離子和羥自由基，其中過(guò)氧化氫zui強(qiáng)，其發(fā)光強(qiáng)度與過(guò)氧化氫水平成正相關(guān)。

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI清理液（Reagent  A）

YIJI強(qiáng)化液（Reagent  B）

YIJI發(fā)光液（Reagent  C）

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

毫升

毫升

毫升

1份

保存方式

保存 YIJI強(qiáng)化液（Reagent  B）和 YIJI發(fā)光液（Reagent  C）在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照；

其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶(hù)自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

臺(tái)式離心機(jī)：用于去除樣品雜質(zhì)

測(cè)試管：用于發(fā)光檢測(cè)用的試管

化學(xué)發(fā)光儀：用于檢測(cè)化學(xué)發(fā)光

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 樣品預(yù)處理

1． 準(zhǔn)備1瓶25cm細(xì)胞培養(yǎng)瓶的新鮮待測(cè)細(xì)胞

2． 小心移取細(xì)胞培養(yǎng)液到15毫升錐形離心管

3． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g

4． 小心移取上清液到新的15毫升錐形離心管

5． 根據(jù)上清液容量和細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出（N）  X 106細(xì)胞/毫升

6． 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里備用（1小時(shí)內(nèi)）

二、 測(cè)讀

測(cè)讀開(kāi)始前，打開(kāi)化學(xué)發(fā)光儀，設(shè)定儀器內(nèi)溫度為37℃預(yù)熱和整合測(cè)讀10秒或  15分鐘；然后關(guān)掉實(shí)驗(yàn)室

的燈光。將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化，嚴(yán)格置于暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

1． 準(zhǔn)備好測(cè)試管，做好標(biāo)記：陰性對(duì)照、樣品本底和樣品活性

2． 移取xx微升   YIJI清理液（Reagent  A）到陰性對(duì)照測(cè)試管

3． 移取xx微升上述預(yù)處理的細(xì)胞培養(yǎng)液到樣品本底測(cè)試管

4． 移取xx微升上述預(yù)處理的細(xì)胞培養(yǎng)液到樣品活性測(cè)試管

5． 分別加入xx微升   YIJI強(qiáng)化液（Reagent  B）到上述測(cè)試管，除樣品本底測(cè)試管外

6． 分別加入xx微升   YIJI發(fā)光液（Reagent  C）到上述測(cè)試管，除樣品本底測(cè)試管外

7． 輕輕渦旋混勻

8． 即刻放進(jìn)37℃化學(xué)發(fā)光儀里測(cè)讀

9． 整合測(cè)讀10秒，獲得相對(duì)發(fā)光單位（relative   light unit；RLU）

10．或者整合測(cè)讀15分鐘，獲得光電子讀數(shù)：X106    CPM（counted photon per minute

）（注意：可以使用液

體閃爍儀替代）

11．計(jì)算 ROS水平：

（樣品活性－樣品本底）  ÷

注意事項(xiàng)

＝X 106 CPM/毫升＝X 106 CPM/【（N）X 106  細(xì)胞】

1． 本產(chǎn)品為50次操作

2． 如果測(cè)定體系變化，則試劑用量相應(yīng)變化

3． 操作時(shí)，須戴手套

4． 測(cè)試前，細(xì)胞培養(yǎng)液須新鮮收集，1小時(shí)內(nèi)為*

5． 樣品制備后即刻測(cè)讀，不宜隔夜保存

6． 培養(yǎng)液上清須澄清

7． 必要時(shí)，例如活性氧族過(guò)低，可以濃縮樣品處理

8． 測(cè)讀的所有步驟均須在暗室里進(jìn)行

9． 如果是注射式化學(xué)發(fā)光儀，建議測(cè)試前后使用無(wú)離子水沖洗化學(xué)發(fā)光儀注射（injector）管道

10．本公司提供系列活性氧分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感