實驗材料:植物葉片

1.實驗步驟
一、 取材料（約1g ，根據具體情況而定），放入冰鎮(zhèn)的培養(yǎng)皿里，加入解離液（約1～2mL），用鋒利分刀片一次性快速切碎，整個過程，材料必須浸沒在解離液里。
二、 吸取培養(yǎng)皿內的解離液，用400目的濾布過濾到冰鎮(zhèn)的離心管中，放置4℃的冰箱中孵育10分鐘。
三、 離心。轉速：1000轉/分，溫度：4℃，時間：8分鐘。
四、去上清，使用BD cycletest plus DNA reagent kit中的B液作用10min，C液染色10min。
五、上機檢測。

1.解離液：
  Chopping Buffer（LB01）
   成分 濃度 用量
   Tris 15mM 363mg
   Na2EDTA 2mM 148.9mg
   精胺 0.5mM 20.2mg
   KCl 80mM 1.193g
   NaCl 20mM 233.8mg
   Triton X-100 0.1% 200ul
   二巰基乙醇 15mM 220ul  
   加去離子水 至200ml
   PH7.5，0.22um濾膜過濾，-20?C凍存。

結果：
   1.樣本：桉樹幼苗的幼嫩葉片（正常體細胞）
   染液：BD cycletest plus DNA reagent kit
        
                File analyzed: Data.002.fcs
                Date analyzed: 31-Mar-2011
                Model: 1DA0n_DSD
                Analysis type: Automatic analysis

                Ploidy Mode: First cycle is diploid

                Diploid: 100.00 %
                Dip G1: 71.49 % at 63.58
                Dip G2: 11.61 % at 127.15
                Dip S: 16.90 %   G2/G1: 2.00
                %CV: 5.23

                Total S-Phase: 16.90 %
                Total B.A.D.: 19.34 %  

                Debris: 42.60 %
                Aggregates: 2.76 %
                Modeled events: 6646
                All cycle events: 3631
                Cycle events per channel: 56
                RCS: 2.674

2.樣本：蝴蝶蘭葉片（嵌合體）
   染液：BD cycletest plus DNA reagent kit
                                                               
分析與總結：
1. 實驗材料的選擇：以選取植物葉片為實驗材料*。若實驗材料取自野外，為避免運輸過程中材料受到高溫的影響，采摘后應立即用濕濾紙包裹置于冰盒中。若不立即進行實驗，可將材料儲存于-70℃冰箱中保存數日。
2. 細胞核的獲取數量：建議獲取20,000—30,000個，因為用modfit分析時，擬合的細胞數至少是10,000個，分析結果*，而植物葉片制備細胞核懸浮液時會產生大量的碎片，會顯著降低擬合細胞的比例，故需提高獲取數量。
3. 獲取模板的優(yōu)化：FSC Vs SSC 選取log放大，以FL2為閾值，有利于排除部分碎片，同時較小的細胞核也不會漏檢，另外，再設置一個FL2 Vs SSC點圖，有利于排除一些帶有色素的細胞器的干擾。

1.研究背景
1.1原生質體的概念
    植物原生質體是指去除細胞壁被質膜所包圍的、具有活力的細胞，其結構包括細胞膜、細胞質(包括各種細胞器、細胞骨架系統(tǒng)及胞基質)和細胞核等部分。原生質體培養(yǎng)和植株再生技術具有使用范圍廣、可行性強等優(yōu)點，是植物生物工程的基礎。對植物原生質體的研究，可追溯到20世紀60年代，英國植物學家Cocking用酶解方法降解細胞壁，獲得了番茄根尖原生質體，自此原生質體的研究得到迅速發(fā)展。近年來，由于原生質體具有結構簡單、發(fā)育同步性好、群體數量大、DNA分子易于進入細胞，易獲得純合性轉化子的特點，及其培養(yǎng)技術與有關的細胞、分子和遺傳等學科的交叉滲透，使植物原生質體的研究越來越受到重視。研究領域也從分離原生質體進行的生理生化和利用不同材料的原生質體得到再生植株的階段轉到原生質體的應用(尤其是遺傳性狀改良)方面。

1.2原生質體的制備
     原生質體的分離方法有兩種：機械分離法和酶解分離法。機械分離法由于產量低、方法繁瑣費力；以及對分生組織和液泡化程度不高的細胞不適用的特點，現在已很少有人使用。                        酶解分離法為目前普遍采用的原生質體分離方法。酶解是在25~28 ℃的恒溫、黑暗或弱光下進行；酶解后經過0.038 mm孔徑左右的鎳絲網過濾，濾去消解不*的組織碎塊（導管、篩管等）和細胞團。然后將濾液離心，棄去上清液，將離心下來的原生質體重新懸浮在洗液(CPW)中，再次離心，去上清液，重復3 次。在倒置顯微鏡下檢查純化效果，效果好，用原生質體培養(yǎng)基離心，效果不好，用質量分數為20%的蔗糖離心，使完整的原生質體浮于液面。             

1.3原生質體的轉化
     1）生物介質介導的遺傳轉化。目前應用的生物介質主要是根癌農桿菌和發(fā)根農桿菌。它們轉化的原理分別是通過活化Ti 和Ri 質粒的Vir 區(qū)基因，達到對T-DNA 轉移的目的。2）細胞融合法。PEG介導法由Davey 等首先建立，主要原理是借助細胞融合劑誘導原生質體攝取外源DNA。PEG法的融合率可達10%~15%，無種屬特異性，幾乎可誘導任何原生質體的融合。細胞電融合法利用細胞在相對電極之間的介電電泳，誘導細胞按特定方向排列，通過電極間產生的較高場強的電脈沖使相互接觸的細胞發(fā)生電穿孔，進而發(fā)生電融合。3）激光微束穿刺法。激光微束穿刺法就是利用直徑很小、能量很高的激光微束引起細胞膜可逆性穿孔，從而使處于細胞周圍的外源DNA 隨之進入細胞的轉基因方法。激光微束穿刺法操作簡便，對細胞的損傷小，可以準確定位于被照射的細胞，實驗重復性好。4）電擊法是利用高壓電脈沖作用，在原生質體膜上“電擊穿孔”，形成可逆的瞬間通道，從而促進外源DNA的攝入。                            

1.4原生質體的應用
    由于原生質體失去了細胞壁這一屏障，因而使其具有特殊的優(yōu)點。原生質體不僅可作為一個單細胞系統(tǒng)來研究細胞壁再生、細胞分裂與分化、攝入細胞器、病毒侵染機理、膜透性及離子轉運等基礎理論研究的理想材料；同時還是原生質體培養(yǎng)和原生質體融合的基礎。而且，近年來以原生質體為材料利用膜片鉗技術研究離子通道及原生質體在受光、脅迫和激素作用后的調節(jié)機制已成為研究的熱點。此外，原生質體也被用來作為研究植物細胞鈣信號轉導及其調節(jié)機制的理想材料。

2.實驗用品
   熒光顯微鏡：觀察轉基因效率，觀察流式分選效率。 
   低速離心機和細胞計數儀：收集細胞及原生質體
   流式細胞儀（BD FACSAriaIII）：分選原生質體
  細胞培養(yǎng)箱：細胞培養(yǎng)

   試劑和緩沖液：
   Protoplast enzyme solution (pH 5.6)
   1% cellulase      
   0.25% macerozyme  
   0.4 M Mannitol (0.5M for Tobacco)
   8 mM CaCl2
   5 mM Mes-KOH  
   BSA 0.1%

   W5 solution ( pH 5.6)
   154 mM NaCl
   125 mM CaCl2
   5 mM KCl
   5 mM Glucose
   1.5 mM Mes-KOH

   MaMg solution (pH 5.6)
   400 mM Mannitol
   15 mM MgCl2
   5 mM Mes-KOH

   PEG solution (can be stored for up to 1 week)
   400 mM Mannitol
   100 mM Ca(NO3)2
   40% PEG (Mw=8000)

   21% sucrose, 1 M Mannitol, 1 M Ca(NO3)2

3.實驗方法
3.1 分離原生質體
   前一天晚上
   1. 使用約15 mL protoplast enzyme solution消化細胞壁。
   A. 選用生長1-3 周的植株 (請根據需要自行優(yōu)化條件) 。
   B. 23oC，孵育7-12小時，溫和震蕩混勻。 
   *天，上午
   2. 用100 ?m濾網過濾收集細胞至標記好的培養(yǎng)皿中。
   3. 在50 ml 管中加入等體積的21% 蔗糖溶液。
   4. 將第二步的細胞溶液加入第三步的蔗糖溶液中。
   5. 梯度離心10 min，750 rmp。
   6. 用藍槍頭從上層中吸取健康的完整的細胞。
   7. 用等體積的W5溶液重懸細胞。
   8. 離心，500 rmp，5min。
   9. 用W5溶液重懸細胞沉淀。
   10. 將細胞置于4 oC 保存直至使用。

3.2 PEG-介導轉化
    *天，下午
    1. 準備用于PEG轉化的原生質體
    A. 預冷新鮮制備的PEG溶液。
    B. 500 rpm，1 min，離心原生質體。
    C. 用MaMg 溶液重懸細胞至合適濃度: 106數量級, 至少300 ?l體積。
    D. 加DNA至一個新的14ml圓底管中– 所加DNA的量取決于表達水平。
    E. 加300 ?l 細胞溶液至管中，溫和混勻。
    2. PEG轉化
    A. 用等體積的PEG(300 ?l + DNA volume)和原生質體 & DNA溶液(step E)混勻，注意要非常溫和。
    B. 室溫孵育30 min。
    3. 用W5溶液逐漸稀釋去除PEG
    A. 700 ?l, 5 min -用剪掉末端的槍頭上下溫和吹打。
    B. 1 ml, 3 min; 2 ml – 每一步溫和的轉動管子。
    C. 離心，500 rpm，5min，棄上清。
    4. 用1 ml W5 溶液重懸細胞沉淀。 
    5. (可選) 從未轉化的對照組中分離蛋白進行Western檢測。
    6. 將細胞置23oC孵育 1-3 天。

3.3 流式分選Protoplast
   1. 對原生質體進行計數，調整原生質體濃度為5*10^6/mL。
   2. 使用BD FACSAriaIII流式細胞儀進行分選，收集GFP+原生質體。
      A.打開準備好的流式細胞分選儀，本實驗使用的是BD FACSAriaIII。
     B.儀器設置為：100µm噴嘴，20 psi鞘液壓力。
      C.細胞密度和樣本上樣速度可以根據特定需要加以調整——要高得率還是高速度。
      D.使用樣本混勻功能，防止在分選過程中原生質體發(fā)生沉降。
      E.畫一張FSC/SSC散點圖，調節(jié)電壓使細胞群體出現在散點圖的*。
      F.再畫一張GFP/PE-Texas Red散點圖，調節(jié)電壓，使野生型對照原生質體群體(non-GFP)   
        出現在散點圖的*，GFP陽性原生質體群體會在GFP熒光通道信號更強的位置現（在野生型對照樣本中沒有這個群體）。
      G.如有必要，調節(jié)補償，使GFP陰性和陽性原生質體群體分得更開。
      H.設置門，圈住GFP陽性群體。需要準備一個non-GFP原生質體陰性對照（Figure 1.）用以確定門的界限。
      I.根據實驗需要以及目的細胞的百分比，選擇合適的分選模式——高得率或者高純度。
      注：初始條件可選取100µm噴嘴，20 psi鞘液壓力。后期根據樣本狀態(tài)的不同，可以進一步優(yōu)化分選條件，包括：選擇更大的噴嘴尺寸，更低的鞘液壓力，用戶自定義分選模式，優(yōu)化原生質體培養(yǎng)緩沖液，使用原生質體培養(yǎng)緩沖液替代鞘液，直接分選原生質體到培養(yǎng)皿中等，都有助于保護分選后原生質體的活性。
      3. 對分選后得到的GFP+原生質體進行離心，棄上清。
      4. 分選原生質體后續(xù)實驗，分析原生質體基因組DNA，蛋白或代謝產物表達水平。

4.實驗結果
                               
                               Figure 1. Negative Control

                               
                               Figure 2. GFP Positive Protoplast