人全血單個(gè)核細(xì)胞分離液說明書
 
【包裝規(guī)格】
 
200ml/瓶
 
【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】
 
A． 適用儀器
 
zui大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)
 
B． 耗材
 

 
【檢驗(yàn)方法】 全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。 首先根據(jù)樣本量大小，分以下幾種情況：
 
一、 使用 15ml 離心管時(shí)：
 
情況 A：血液樣本量小于 3ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
 
1.     取一支 15ml 離心管，加入 3ml 分離液。
 
2.     用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，400-650g，離心 20-30min（注：根據(jù)血 液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件 需客戶自行摸索，以達(dá)到*分離效果）。
 
3.     離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個(gè) 核細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
 
4.     用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管 中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。
 
5.     250g，離心 10min。
 
6.     棄上清。
 
7.     用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。

 
8.     250g，離心 10min。
 
9.     重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。 情況 B：血液樣本量為 3-6ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
 
1.     取一支 15ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。
 
2.     用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，400-650g，離心 20-30min（注：根據(jù)血 液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件 需客戶自行摸索，以達(dá)到*分離效果，但zui大離心力不超過 1000g）。
 
3.     離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個(gè) 核細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
 
4.     用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管 中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。
 
5.     250g，離心 10min。
 
6.     棄上清。
 
7.     用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
 
8.     250g，離心 10min。
 
9.     重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
 
二、 使用 50ml 離心管時(shí)：
 
情況 A：血液樣本量為 6-10ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
 
1.     取一支 50ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。
 
2.     用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，500-950g，離心 20-30min（注：根據(jù)血 液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件 需客戶自行摸索，以達(dá)到*分離效果，但zui大離心力不超過 1200g）。
 
3.     離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個(gè) 核細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
 
4.     用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管 中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。
 
5.     250g，離心 10min。
 
6.     棄上清。
 
7.     用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。

 
8.     250g，離心 10min。
 
9.     重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。 情況 B：血液樣本量為 10-20ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
 
1.     取一支 50ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。
 
2.     用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，650-110g，離心 20-30min（注：根據(jù)血 液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件 需客戶自行摸索，以達(dá)到*分離效果，但zui大離心力不超過 1200g）。
 
3.     離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個(gè) 核細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
 
4.     用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管 中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。
 
5.     250g，離心 10min。
 
6.     棄上清。
 
7.     用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
 
8.     250g，離心 10min。
 
9.     重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
 
【注意事項(xiàng)】
 
1.   全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得*的實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 在取血 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，血液存放時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞分離效果越差。血液放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。
 
2.   本實(shí)驗(yàn)不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無靜電、低靜電離 心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面 會(huì)變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。
 
3.   吸取過多的單個(gè)核細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的
 
粒細(xì)胞數(shù)量增加。
 
4.   吸取過多的單個(gè)核細(xì)胞層上層溶液會(huì)導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。
 
5.   如所實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過低，請(qǐng)以尋求幫助，具體 詳見下方生產(chǎn)企業(yè)信息。
 
6.   當(dāng)血液樣本粘度過高需稀釋時(shí)，*稀釋方法：將血液與樣本稀釋液（產(chǎn)品編號(hào)：
 
2010C1119）1:1 稀釋混勻備用。注：不當(dāng)?shù)南♂尫椒〞?huì)降低細(xì)胞得率及活性。如血液樣
 

 
本經(jīng)過稀釋則分離過程中需適當(dāng)降低離心力和離心時(shí)間。
 
【儲(chǔ)存條件及有效期】
 
18-25℃保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟 封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。 【參考值（參考范圍）】
 
本實(shí)驗(yàn)淋巴細(xì)胞提取率及純度均大于 80%。
 
下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。
 

 
1.     所獲得淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。
 
2.     所獲得淋巴細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。
 
3.     所獲得淋巴細(xì)胞的鑒定方法 A.流式細(xì)胞技術(shù) B.免疫組化技術(shù)
 
C.原位雜交技術(shù)
 
D.PCR 技術(shù) 注：上述技術(shù)方案詳情請(qǐng)登陸本搜索“細(xì)胞
 
分離、純化、擴(kuò)增及鑒定指導(dǎo)手冊(cè)”，并在說明書項(xiàng)目欄下下載使用。 【可能存在的問題及解決方法】
 
1.  由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：
 

 
2.  本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地
 
 

 
區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，恒定離
 
心時(shí)間，對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。
 
3.  本分離液依照標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級(jí)原料，性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可
 
能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不*的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。
 
注：在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達(dá)到*分離效 果，離心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)。