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吖啶橙熒光染色法基本原理：

    吖啶橙（acridine orange，AO）是一種常用熒光染料，吖啶橙與原代細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA都有親和力，但有一定的特異性，即結(jié)合后發(fā)不同顏色的熒光，DNA呈亮綠色，而RNA呈橘紅色至火紅色。此法簡(jiǎn)便快捷，既可染活原代細(xì)胞又可染固定原代細(xì)胞。用于直接染色觀察活原代細(xì)胞或固定染色觀察原代細(xì)胞均可。吖啶橙對(duì)活原代細(xì)胞毒性小，配成1×10-4-2×10-4可用于直接染色活原代細(xì)胞和進(jìn)行熒光顯微鏡觀察，但不持久，用固定染色觀察法效果更好。

 

材料：

1.蓋片單層培養(yǎng)原代細(xì)胞；

2.固定劑：95%乙醇或乙酸/甲醇（現(xiàn)配）；

3.吖啶橙：用生理鹽水配成1%的干液。使用時(shí)再用PBS稀釋成1×10-4-2×10-4mol/L pH4.5-5.0的染色液；

4.0.1mol/L的CaCl2；

5.1%乙酸。

 

染色步驟：

1.將蓋片單層培養(yǎng)原代細(xì)胞從瓶中取出，立即用溫Hanks液漂洗3-5s，以去除培養(yǎng)基中血清；

2.投入95%乙醇或乙酸/甲醇固定15-30min，用濾紙接觸蓋片邊緣，蓋片微干；

3.用1%乙酸酸化30s；

4.用1×10-4-2×10-4的吖啶橙染液染色30s或1min；

5.用0.1mol/L的CaCl2處理30s-2min；

6.PBS漂洗3次，每次數(shù)秒；

7.PBS封片，熒光顯微鏡下直接觀察并拍照；

8.注意事項(xiàng)：觀察中應(yīng)隨時(shí)填加PBS以避免標(biāo)本干涸。如用油浸鏡觀察，需再覆以大蓋片蓋在附有原代細(xì)胞蓋片上，保證原代細(xì)胞面朝上，用無熒光性油浸鏡觀察。原代細(xì)胞蓋片標(biāo)本在95%乙醇中能保存數(shù)日后仍可觀察，如退色，再用AO染色。鏡下觀察，DNA呈翠綠色，RNA呈火紅色。 結(jié)果：原代細(xì)胞核因含DNA呈綠色，細(xì)胞質(zhì)及核仁因含RNA呈紅色。