在不附加任何保護劑下直接凍存細胞時，細胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導(dǎo)致細胞內(nèi)發(fā)生機械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH 改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細胞。貯存在﹣130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。

細胞凍存時脫離生長狀態(tài)而將其細胞特性保存起來，待復(fù)蘇時重新進入生長分裂周期。

實驗開始前，將凍存管、15 毫升離心管、移液管、移液槍、槍頭等放入無菌超凈工作臺，以紫外線照射 30 分鐘。采用通風(fēng)機通風(fēng) 3 分鐘。以 75%酒精擦拭操作臺和雙手。準(zhǔn)備好冰盒。

將離心機調(diào)節(jié)至 800 轉(zhuǎn)，5 分鐘。水浴箱調(diào)節(jié)至 37 度恒溫。取細胞培養(yǎng)基、DMSO、胰蛋白酶等，放于水浴箱中預(yù)熱。

首先消毒雙手和超凈臺。取約 10ml細胞培養(yǎng)基放于 15 毫升離心管中。

配置細胞凍存液：凍存液應(yīng)該提前配制，置于室溫備用，防止臨時配制產(chǎn)生的熱量損傷細胞，按無血清培養(yǎng)基 比 血清 比 DMSO=7:2:1 的比例配置細胞凍存液，其中加大凍存液中血清的比例對于保存某些脆弱的干細胞以及一些比較珍貴的細胞很有好處的。

按比例加好凍存液組分后，輕輕吸打混勻，置于室溫下待用。

從細胞培養(yǎng)箱中取出細胞，進行瓶口消毒，棄去細胞原來的培養(yǎng)基。按每 25cm2/ml胰酶/EDTA 消化液比例加入消化液，放入顯微鏡下觀察，待所有細胞變圓后立即拿入超凈臺內(nèi)，加入2ml細胞培養(yǎng)基以立即終止消化。

采用無菌槍頭輕輕吹打細胞表面，注意吹打全部培養(yǎng)表面，可以按照先左右吹打，后上下吹打的方式，取所有細胞懸液放入一干凈的15毫升離心管內(nèi)。

配平離心：采用天平配平兩端，每分鐘 800 轉(zhuǎn)，室溫離心 5 分鐘。

采用羅氏 CASY-DT 快速細胞計數(shù)及活率分析儀進行細胞計數(shù)。加入 10ml CASY-ton至以標(biāo)記 viable 的管子中，加入 100µl 細胞懸液，顛倒混勻三次，可進行細胞計數(shù)。可見每毫升懸液中有活細胞總數(shù)。

取出凍存管，注明細胞名稱、代數(shù)、日期。

離心后，以無菌吸管吸棄上清液，不要吸到底部的細胞沉淀。將細胞沉淀與凍存液充分混勻，根據(jù)計數(shù)結(jié)果，將細胞總數(shù)調(diào)節(jié)至細胞數(shù)量為每毫升有 5×10?為宜。

將細胞凍存懸液分裝入細胞凍存管中，一般一個兩毫升凍存管裝入 1 至 1.5 毫升細胞凍存懸液為宜。

嚴(yán)密封口后，進行程序性降溫凍存：

首先 ﹣4 ℃ 30 分鐘，20 ℃ 30 分鐘，﹣80 ℃過夜，最后進行液氮保存。