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感覺神經(jīng)元的高對比度快速三維成像
深入了解此類神經(jīng)元在觸覺和痛覺中的作用
本文討論了相比傳統(tǒng)的寬場顯微鏡，使用large volume computational clearing（LVCC）技術的THUNDER組織成像系統(tǒng)如何獲取背根神經(jīng)節(jié)（DRG）組織高對比度的快速三維成像圖，獲得感覺神經(jīng)元更為清晰的解析圖像。神經(jīng)科學研究的一項主要領域集中在感覺神經(jīng)元對觸覺和痛覺的影響方面。深入理解這種現(xiàn)象對于神經(jīng)系統(tǒng)疾病和療法的發(fā)展具有重要意義。
簡
介
確定感覺神經(jīng)元的多樣性及其在觸覺和痛覺中的作用，對于診斷和治療周圍病變（即周圍神經(jīng)系統(tǒng)的常見疾?。┓浅Ｖ匾?sup style="margin: 0px; padding: 0px; outline: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; overflow-wrap: break-word !important; font-size: 12px;">[1,2]。了解感覺缺陷、慢性疼痛和感覺神經(jīng)元病理變化之間的聯(lián)系，有助于開發(fā)新的疼痛療法，以改善神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。此報告結(jié)果表明，使用THUNDER成像技術對感覺神經(jīng)元進行高對比度的快速三維成像可以幫助研究人員深入了解病變。
挑
戰(zhàn)
一種能夠快速獲取厚神經(jīng)節(jié)組織的高對比度成像，使重要的標本細節(jié)得到清晰解析的成像方法，對于病變研究非常重要。傳統(tǒng)的寬場顯微鏡具有出色的速度和檢測靈敏度，但由于存在厚組織的離焦平面信號，此類圖像通常會存在離焦模糊或霧面現(xiàn)象。這些因素會顯著降低圖像對比度[3,4]。
方
法
背跟神經(jīng)節(jié)（DRG）的組織標本來自感覺神經(jīng)元亞群表達tdTomato（紅色）的轉(zhuǎn)基因小鼠。采用多聚甲醛固定的20μm的冷凍切片用抗mCherry一級抗體過夜孵育，然后用Cy3偶聯(lián)的二級抗體染色，并用Fluoromount G封片。背景神經(jīng)元自發(fā)熒光可以通過GFP濾光片組檢測，以實現(xiàn)神經(jīng)元計數(shù)（綠色）。使用THUNDER組織成像系統(tǒng)和large volume computational clearing（LVCC）技術獲取三維z堆棧圖像[3,4]。然后用LAS X擴展景深處理工具創(chuàng)建二維投影圖。
結(jié)
果
使用THUNDER成像技術采集的神經(jīng)節(jié)組織標本圖像如下圖1所示。
圖1：小鼠背根神經(jīng)節(jié)中某些感覺神經(jīng)元中表達tdTomato（紅色）的原始寬場圖像（A）和THUNDER成像圖像（B）。圖片來自美國威斯康星大學麥迪遜分校，病理生物學系獸醫(yī)學院LaTasha K. Crawford博士。
結(jié) 論
THUNDER組織成像系統(tǒng)和large volume computational clearing（LVCC）可以通過消除離焦模糊讓小鼠組織的寬場熒光圖像變清晰，從而揭示背根神經(jīng)節(jié)的精細結(jié)構(gòu)細節(jié)。
參考文獻：
1.L.K. Crawford, M.J. Caterina, Functional Anatomy of the Sensory Nervous System: Updates From the Neuroscience Bench, Toxicologic Pathology (2020) vol. 48, iss. 1, pp. 174-189, DOI: 10.1177/0192623319869011.
2.E.L. Tran, L.K. Crawford, Revisiting PNS Plasticity: How Uninjured Sensory Afferents Promote Neuropathic Pain, Front. Cell. Neurosci. (2020) vol. 14, DOI: 10.3389/fncel.2020.612982.
3.J. Schumacher, L. Bertrand, THUNDER Technology Note: THUNDER Imagers: How Do They Really Work? Science Lab (2019) Leica Microsystems.
4.L. Felts, V. Kohli, J.M. Marr, J. Schumacher, O. Schlicker, An Introduction to Computational Clearing: A New Method to Remove Out-of-Focus Blur, Science Lab (2020) Leica Microsystems.