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            免疫組化IHC常見(jiàn)問(wèn)題

            點(diǎn)擊次數(shù):1640 發(fā)布時(shí)間:2021-8-16

            IHC信號(hào)微弱/無(wú)信號(hào)
            問(wèn)題解決方案
            抗體效力a. 抗體效價(jià)不高。可通過(guò)增加抗體使用濃度,延長(zhǎng)抗體孵育時(shí)間進(jìn)行調(diào)整。
            b. 
            所用抗體不適用于IHC實(shí)驗(yàn)。建議在非變性WB上測(cè)試該抗體,以確??贵w識(shí)別非變性抗原,或是選用通過(guò)IHC實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的抗體。
            c. 
            一抗二抗不匹配。使用針對(duì)一抗物種來(lái)源的二抗,如一抗宿主為rabbit,則須使用anti-rabbit的二抗。
            d. 
            抗體失活。避免將標(biāo)記熒光基團(tuán)的二抗放置于光照環(huán)境。
            酶底物失活或呈色時(shí)波長(zhǎng)設(shè)置錯(cuò)誤a. 顯色溶液失去作用,可能是由于底物緩沖液中含有酶抑制劑,或底物緩沖液的pH值不適當(dāng)。建議取一滴二抗標(biāo)記酶與底物溶液反應(yīng)可確認(rèn)顯色溶液是否失去活性。
            b. 
            錯(cuò)誤的激發(fā)波長(zhǎng)。呈色前確保激發(fā)波長(zhǎng)與使用的熒光基團(tuán)相匹配。
            樣品制備問(wèn)題a. 脫蠟作用不足。建議延長(zhǎng)脫蠟時(shí)間,使用新鮮配制的二甲苯。
            b. 
            固定液(福爾馬林或 PFA) 可能改變表位。建議利用抗原修復(fù)方式使表位暴露出來(lái)或縮短固定作用的時(shí)間。
            c. 
            固定作用不適當(dāng)。避免延遲固定或過(guò)度固定,一般建議至少固定6小時(shí)以上,18~24小時(shí)已可滿(mǎn)足大多數(shù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。
            d. 
            冰凍切片樣品保存期過(guò)長(zhǎng)。冰凍切片制備完成后,最好于1-2個(gè)月內(nèi)用完,超過(guò)6個(gè)月的話,建議制備新的玻片。
            e. 
            熒光染色樣品保存不當(dāng)。熒光基團(tuán)在光線下暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng),可能會(huì)導(dǎo)致信號(hào)減弱,建議在避光環(huán)境下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和保存樣品,也可使用防熒光淬滅的封片劑封固樣本。
            樣品屬性a. 靶蛋白含量低。建議設(shè)置為陽(yáng)性対照組,增加抗體使用量或利用放大步驟來(lái)放大信號(hào)。
            b. 
            靶蛋白為核蛋白而抗體不能穿透細(xì)胞核。建議在封閉溶液與抗體稀釋液中加入滲透試劑,以促進(jìn)抗體滲透到細(xì)胞內(nèi)。
            c. 
            靶蛋白為膜蛋白而表位可能因?yàn)闈B透作用被破壞或移除。建議將緩沖液中的滲透試劑減少或移除。
            d. 
            較厚的組織。如斑馬魚(yú)全胚胎或染色建議做細(xì)胞破膜,以便抗體順利進(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。
            關(guān)鍵步驟:在每次的實(shí)驗(yàn)中,設(shè)置陽(yáng)性與陰性對(duì)照組,以確認(rèn)是該次實(shí)驗(yàn)的抗體、試劑、組織切片、實(shí)驗(yàn)過(guò)程的問(wèn)題,還是靶蛋白自身表達(dá)量低的問(wèn)題。
            IHC非特異性染色/背景值比較高
            問(wèn)題解決方案
            固定方式或組織自身可能存在自發(fā)熒光a. 嘗試用非醛類(lèi)替代醛類(lèi)。
            b. 
            用淬滅自發(fā)熒光的染料或方法處理組織樣品:如硼氫化na、短波長(zhǎng)的UV照射、蘇丹黑等。
            c. 
            將石蠟包埋樣品的方法換成冰凍切片(OCT或明膠),減少固定液的影響。
            d. 
            選擇不會(huì)與自發(fā)熒光競(jìng)爭(zhēng)的熒光染料。福爾馬林、PFA或戊二醛等會(huì)產(chǎn)生高背景的熒光,尤其在使用綠色、藍(lán)色和紅色波長(zhǎng)光譜范圍時(shí);組織中的紅細(xì)胞或膠原蛋白等組分會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的自發(fā)熒光,尤其是使用綠色和紅色通道的熒光檢測(cè)時(shí)。
            e. 
            組織沖洗不*,有固定液殘留。
            f. 
            使用福爾馬林或PFA固定過(guò)久。一般建議至少固定6小時(shí)以上,18~24小時(shí)已可滿(mǎn)足大多數(shù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用,注意:如固定時(shí)間到了無(wú)法繼續(xù)后續(xù)脫水、包埋程序,一定要將組織置換到PBS保存,切勿一直泡于固定液中,否則有可能造成蛋白交聯(lián)無(wú)法修復(fù)。
            g. 
            配置新鮮的固定液
            封閉、洗脫或顯色問(wèn)題a. 增加封閉液濃度、延長(zhǎng)封閉時(shí)間。
            b. 
            更換封閉液成分,注意封閉液成分不可與一抗物種同來(lái)源,最好與二抗物種同源,如二抗來(lái)自馬血清,使用馬血清可得到較干凈的背景。
            c. 
            底物過(guò)量:縮短底物孵育時(shí)間。
            d. 
            信號(hào)過(guò)度放大:縮短信號(hào)放大試劑孵育時(shí)間。
            e. 
            洗脫液不適合:如果原本是用PBS,可更換使用TBS
            抗體濃度太高或非特異性結(jié)合a. 降低抗體濃度,如1100調(diào)整為11000
            b. 
            縮短抗體孵育時(shí)間,并在4°c 孵育。
            c. 
            增加封閉緩沖液濃度。
            d. 
            做多個(gè)目標(biāo)蛋白染色時(shí),建議使用預(yù)吸附二抗減少與其他物種一抗的交互作用。
            e. 
            針對(duì)二抗與組織發(fā)生非特異性結(jié)合的情況建議每次實(shí)驗(yàn)都要設(shè)置一組不加一抗,只加二抗的對(duì)照組,才能確認(rèn)信號(hào)是來(lái)自高背景值還是真實(shí)信號(hào)。
            內(nèi)源性酶(過(guò)氧化氫酶或堿性磷酸酶)a. 使用酶抑制劑。
            過(guò)氧化物酶:使用H2O2 (0.3% v/v)
            堿性磷酸酶:使用 Levamisol (2 mM)
            內(nèi)源性生物素 Avidin 孵育以封閉生物素
            組織問(wèn)題a. 脫蠟不*,可能導(dǎo)致細(xì)胞核染色在呈相時(shí)模糊,亦可能導(dǎo)致抗體無(wú)法辨認(rèn)抗原或者高背景值。
            b. 
            抗原修復(fù)方式不適合,建議更換修復(fù)溶液成分或方法。
            c. 
            一抗與組織物種同源。較常發(fā)生在使用鼠源抗體染鼠源組織時(shí),除了避開(kāi)同樣物種來(lái)源的一抗和組織之外,也可以使用 Mouse-on-Mouse IHC染色試劑盒 (GTX83396) 迸行實(shí)驗(yàn)。
            d. 
            任何時(shí)候都不要讓組織干掉。


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