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液相色譜儀分析肉食品中常見(jiàn)4種抗生素殘留
大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)與氯霉素類(lèi)藥物是兩類(lèi)應(yīng)用廣泛的廣普抗生素，由于這兩類(lèi)抗生素能夠有效預(yù)防和治療家畜傳染病和寄生蟲(chóng)病的發(fā)生，有些還具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的功用。因此，為了降低養(yǎng)殖成本，提高經(jīng)濟(jì)效益，在家畜養(yǎng)殖中廣為使用。但是，近年來(lái)由于在禽畜養(yǎng)殖過(guò)程中過(guò)量使用抗生素又不遵守休藥期的規(guī)定，在牛羊肉、豬肉以及雞鴨魚(yú)肉中檢測(cè)出了各種抗生素。這種殘留可以通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，進(jìn)而對(duì)人體造成各種危害。紅霉素、泰樂(lè)菌素等大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)可致肝損害和聽(tīng)覺(jué)障礙。更嚴(yán)重的是長(zhǎng)期大量濫用廣譜抗生素會(huì)導(dǎo)致腸道微生物菌群被抑制，使人體產(chǎn)生抗藥性，這種抗藥性導(dǎo)致人類(lèi)感染疾病之后治療難度加大，治療成本升高?！ 榱吮Ｕ先祟?lèi)的生命健康，世界各國(guó)衛(wèi)生組織以及食品藥品監(jiān)督管理部門(mén)都已經(jīng)將肉食品中各種抗生素殘留量作了嚴(yán)格規(guī)定，并且以抗生素在肉食品中的殘留量作為產(chǎn)品進(jìn)口的貿(mào)易壁壘，如美國(guó)和歐盟對(duì)阿維菌素在肉食品中的zui高殘留*為25ug/kg，泰勒菌素為100ug/kg，替米考星為100ug/kg，伊維菌素為40ug/kg。目前肉食品中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素常用液一質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行全面分析。氯霉素類(lèi)藥物常用氣相色譜及液相色譜分析。而用液相色譜法同時(shí)分析肉食品中兩類(lèi)常見(jiàn)抗生素還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
一、LC2100高壓恒流泵：2臺(tái)
uv2100紫外檢測(cè)器：1臺(tái) N2000色譜工作站：1臺(tái)7725i手動(dòng)進(jìn)樣閥：1套
色譜工作站：1套
二、LC2100液相色譜儀特點(diǎn)
★采用世界上zui的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)（安捷倫液相色譜檢測(cè)系統(tǒng)），交差光路設(shè)計(jì)
★輸液泵單向閥來(lái)源自世界zui的輸液泵技術(shù)
★ 傳承了美國(guó)瓦里安技術(shù)，確保了泵的可靠性及穩(wěn)定性
★ 檢測(cè)器采用了安捷倫科技技術(shù)
★ 在國(guó)內(nèi)同行業(yè)真正不需換燈，實(shí)現(xiàn)全波長(zhǎng)可變檢測(cè)分析
★ 智能化高，可實(shí)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)化平臺(tái)監(jiān)控，提高了你的QC效益。
★ 自動(dòng)化，讓你從繁鎖的分析操作中解放出更多的時(shí)間！
技術(shù)特點(diǎn)
★ 輸液泵單向閥來(lái)源自瑞士進(jìn)口、密封圈來(lái)自美國(guó)*、氘燈以及氘燈電源來(lái)自德國(guó)*、管路和各種接頭來(lái)源自美國(guó)*
★ 泵形式：串聯(lián)雙柱塞 浮動(dòng)式密封圈；泵頭自沖洗功能，泵無(wú)須手動(dòng)排空即可輸液
“自吸式單向閥"技術(shù)，可延長(zhǎng)密封圈使用壽命；
★ 程序化的溶劑類(lèi)和壓縮因子，可自動(dòng)補(bǔ)償；完整的預(yù)清洗功能，更于快速溶劑更換
★ 三條流量校正曲線以及*的多點(diǎn)參數(shù)校正，保障了*的流量準(zhǔn)確性；
★ 梯度：高壓2-3元；梯度方式：高壓，梯度洗脫內(nèi)部軟件可自控制，可通過(guò)PC機(jī)及泵控制
★ 紫外檢測(cè)器具有自動(dòng)波長(zhǎng)定位調(diào)整，自動(dòng)調(diào)零，多量程輸出選擇
★ D2燈（德國(guó)原裝）：壽命3500小時(shí)，保證使用2000小時(shí)
三、高壓恒流輸液泵技術(shù)參數(shù)：
流量范圍 | 0.001ml/min~ 10.000ml/min 分析型輸液泵 步長(zhǎng)設(shè)定0.001ml/min |
0.01ml/min~ 20.00ml/min 小制備型輸液泵 步長(zhǎng)設(shè)定0.01ml/min | |
0.02ml/min~ 80.00ml/min 半制備型輸液泵 步長(zhǎng)設(shè)定0.01ml/min | |
0.1ml/min~ 200.00ml/min 制備型輸液泵 步長(zhǎng)設(shè)定0.1ml/min | |
流量準(zhǔn)確度 | 小制備以下時(shí)， 準(zhǔn)確度<=±1%（1.0ml/min,8.5mpa,甲醇，室溫） |
半制備以上時(shí)， 準(zhǔn)確度<=±1.5%（40.0ml/min,8.5mpa,甲醇，室溫） | |
流量穩(wěn)定性 | 小制備以下時(shí)，RSD<=0.25% |
半制備以上時(shí)，RSD<=0.7% | |
zui高工作壓力 | 分析型輸液泵： 40Mpa （0.001ml/min~ 10.000ml/min） |
小制備型輸液泵： 35Mpa （0.01ml/min~ 20.00ml/min） | |
半制備型輸液泵： 25Mpa （0.02ml/min~ 80.00ml/min ） | |
制備型輸液泵： 10Mpa （0.02ml/min~ 80.00ml/min ） | |
壓力脈動(dòng) | < 0.1Mpa （1.0ml/min,8.5mpa,甲醇，室溫） |
電源 | AC220 60HZ |
功耗 | 100W |
外形尺寸 | 360*260*170mm，13kg |
四、紫外可見(jiàn)檢測(cè)器技術(shù)參數(shù)
線性范圍 | 104 |
波長(zhǎng)范圍 | 190nm-720nm |
波長(zhǎng)重復(fù)性 | ±0.1nm |
波長(zhǎng)準(zhǔn)確度 | ±1nm |
譜帶寬度 | 6nm |
基線噪聲 | ≤±1×10-5AU （甲醇，1ml/min，254nm，20℃） |
基線漂移 | ≤±2×10-4AU/hr （甲醇，1ml/min，穩(wěn)定時(shí)間60min，254nm，20℃） |
基線噪聲 | ≤±0.5×10-5AU （空池，響應(yīng)時(shí)間1秒，20℃） |
基線漂移 | ≤±0.5×10-4AU/hr （空池，響應(yīng)時(shí)間1秒，穩(wěn)定時(shí)間60min，20℃） |
zui小檢測(cè)濃度 | ≤1×10-9g/ml（萘/甲醇溶液） |
流通池體積 | 分析型:10μL 小制備、半制備:5μL 制備型:3μL |
光程 | 10mm，5mm,3mm |
光源 | 可選氘燈/鎢燈 |
電源 | AC 110V/220V, 50Hz/60Hz |
功耗 | 100W |
外形尺寸（長(zhǎng)×寬×高） | 360mm×260mm×170mm/10.0kg |
三、實(shí)驗(yàn)
1 儀器與試劑
京科瑞達(dá) LC-2100高壓恒流泵
uv2100紫外檢測(cè)器
超聲波清洗儀
反相色譜柱C18
固相萃取柱
泰樂(lè)菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品均為天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心監(jiān)制
乙腈、正己烷均為優(yōu)級(jí)純
其它試劑均為分析純
實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水
新鮮牛肉與雞肉均為超市所購(gòu)
2 色譜條件
C18反相色譜柱
柱溫25℃，流速1mL/min，進(jìn)樣量25uL，梯度洗脫條件A相為甲醇，B相為0.2mol/L磷酸二氫鈉含10%(體積比)甲醇，調(diào)節(jié)pH為3.0，梯度洗脫程序：0-2min10%A，2-8min 10%-40%A，8-9min40%-10%A，檢測(cè)波長(zhǎng)入為275nm
3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
分別準(zhǔn)確稱(chēng)取各標(biāo)準(zhǔn)品0.01g（至0.001g），用甲醇分別溶解并定容至100mL，配制成100mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于一4℃冰箱中冷藏，測(cè)定時(shí)將各標(biāo)準(zhǔn)溶液混合后稀釋成0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0mg/L的溶液。分別以泰樂(lè)菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)（r）。
4 樣品處理
將新鮮牛肉及雞肉分別勻漿后，于-18℃冰箱中保存。測(cè)定時(shí)，將勻漿冷凍保存的牛肉與雞肉樣品于室溫下自然解凍。分別準(zhǔn)確稱(chēng)取20.0g樣品置于50mL具塞錐形瓶中，加入20mL乙腈，超聲10min，轉(zhuǎn)移至離心管，以5000r/min離心10min，收集上清液，離心沉淀物用上述方法重復(fù)提取2次，合并上清液。向得到的清夜中加入30mL正己烷，用力振蕩5min，靜置分層，棄去上層正己烷層。然后將溶液于40℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約2mL，氮?dú)獯蹈珊蠹尤?mL甲醇一磷酸鹽混合液超聲溶解抗生素，定容至10mL?！ ?/span>
5樣品凈化
將HLB固相萃取小柱用5mL甲醇、5mL去離子水活化后，將4得到的樣品處理液上固相萃取柱(柱流速保持1滴/s），用10mL蒸餾水、10mL5%甲醇水溶液淋洗固相萃取柱，再用10mL甲醇洗脫，將洗脫液用氮?dú)獯蹈珊?，加入流?dòng)相超聲定容至5mL，zui后，經(jīng)0.22um濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣?！ ?/span>
6方法的準(zhǔn)確度、精密度、線性范圍、回收率
對(duì)于牛肉樣品分別添加0.1、0.5、1.0mg/kg 3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照4與5樣品處理及凈化方法，每個(gè)水平平行測(cè)定4次，進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，并且以3倍信噪比分別計(jì)算泰樂(lè)菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考在牛肉樣品中的檢出限，在測(cè)定條件下4種藥物在0.1—20mg/L范圍內(nèi)均呈線性，線性方程與相關(guān)系數(shù)、平均回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表
7、實(shí)際樣品檢測(cè)
本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)10份牛肉樣品和10份雞肉樣品中泰樂(lè)菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考進(jìn)行檢測(cè)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)牛肉樣品中含有以上抗生素，但是在4份雞肉樣品中都不同程度檢測(cè)到了泰樂(lè)菌素，zui高為200ug/kg，zui低為80ug/kg，平均含量為120ug/kg，高于我國(guó)動(dòng)物性食品中獸藥zui高殘留*（100ug/kg）
我國(guó)動(dòng)物性食品中獸藥zui高殘留*規(guī)定泰樂(lè)菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考在肉品中的zui高殘留量（MRL）分別為100、75、1.5、200ug/kg，本實(shí)驗(yàn)所測(cè)泰樂(lè)菌素、替米考星、氟苯尼考的檢出限分別為20、32、16ug/kg均在zui高殘留*以下，符合殘留檢測(cè)分析要求。由于氯霉素藥物特殊性，歐盟對(duì)氯霉素的檢出限要求為0.1ug/kg，美國(guó)FDA對(duì)氯霉素的檢出限要求為0.3ug/kg，按照本實(shí)驗(yàn)方法，氯霉素檢出限為19ug/kg，還未達(dá)到上的要求，這是因?yàn)樘崛》椒ê退脵z測(cè)器所致。今后應(yīng)該發(fā)展更加靈敏的方法以提高氯霉 素。本實(shí)驗(yàn)方法的平均回收率較高（75%-87%），而且步驟簡(jiǎn)單、操作容易、重現(xiàn)性較好 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.35%-5.41%，表明方法穩(wěn)定可靠。