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環(huán)狀二硫鍵橋肽的自動合成
檢測樣品：環(huán)狀二硫鍵橋肽
檢測項目：多肽合成
方案概述：使用自動微波增強多肽固相合成可以快速有效地合成二硫鍵橋接環(huán)肽。催產(chǎn)素的常規(guī)室溫合成需要超過13小時才能生成二硫鍵橋接肽。使用微波增強SPPS，該肽在3小時內(nèi)合成，純度為69%。
使用微波增強的多肽固相合成（SPPS）可以快速制備具有良好純度的環(huán)狀二硫鍵多肽（Cyclic disulfide-bridged peptides）。肽激素催產(chǎn)素（Oxytocin）1的合成在3小時內(nèi)完成，純度為69%。BMP受體激活素樣激酶3(BMP receptor activin-like kinase 3，Alk3) 肽激動劑THR-1232的制備在3小時內(nèi)完成，純度為77%。CHEC-73是一種淀粉樣蛋白生成的神經(jīng)保護肽抑制劑，可在3小時內(nèi)制備，純度為80%。后，在4小時內(nèi)合成了一種來自錐螺的肽毒素(conotoxin-SI)4，其含有兩個二硫鍵，純度67%。
簡介
通過使用正交保護的半guang氨suan氨基酸，例如Fmoc-(S)-Cys(Mmt)- OH和Fmoc-(S)-Cys(STmp)-OH，SPPS可以制備具有二硫鍵的肽（圖1）。Cys(Mmt)基團可以使用三fu乙suan(TFA)的稀溶液選擇性脫保護，而Cys(STmp) 基團使用二硫蘇糖醇(DTT)作為還原劑進行正交脫保護。去保護后，可以使用N-氯代琥珀酰亞胺(NCS)作為溫和氧化劑，選擇性氧化半guang氨suan硫醇基團以形成二硫鍵7。將微波能量應(yīng)用于二硫橋肽的合成可以實現(xiàn)更有效的偶聯(lián)，從而節(jié)約合成時間和提高純度(CarboMAXTM)8。
圖1 左：Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH；
右：Fmoc-(S)-Cys(STmp)-OH
材料和方法
試劑
使用CEM Liberty Blue™自動微波肽合成儀在0.526g Rink Amide ProTide LL樹脂（離子交換容量：0.19 meq/g ）上以0.10mmol規(guī)模合成多肽（圖2），以0.05mmol規(guī)模進行二硫化物形成。用20%哌啶和0.1M Oxyma Pure的DMF溶液進行脫保護。偶聯(lián)反應(yīng)在5倍過量的0.2M Fmoc-AA與1.0M DIC和1.0M Oxyma Pure的DMF中進行(CarboMAX)8。Fmoc-(S)- Cys(Mmt)OH用作C端氨基酸。2%TFA的DCM溶液用于去保護Cys(Mmt)基團。使用25mM NCS在DMF中的溶液形成二硫化物。使用具有95:2.5:2.5 TFA/H2O/TIS的CEM Razor™高通量肽切割系統(tǒng)進行切割。裂解后，用無水乙mi沉淀肽并凍干過夜。
圖2：催產(chǎn)素
多肽合成: THR-123, CYFDDSSNVLCKKYRS-CO2H
使用CEM Liberty Blue自動微波肽合成儀在0.556g Cl-MPA ProTide LL樹脂（離子交換容量：0.18 meq/g）上以0.10mmol規(guī)模合成肽（圖3）（以0.05mmol規(guī)模進行二硫化物形成）。用20%哌啶和0.1M Oxyma Pure的DMF溶液進行脫保護。偶聯(lián)反應(yīng)在5倍過量的0.2M Fmoc-AA 1.0M DIC和1.0M Oxyma Pure在DMF(CarboMAX)中進行。8Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH用于半guang氨suanC。A溶液DCM中2%TFA用于去保護Cys(Mmt)。使用25mM NCS在DMF中的溶液形成二硫化物。使用具有95:2.5:2.5 TFA/H2O/TIS 的CEM Razor高通量肽切割系統(tǒng)進行切割。裂解后，用無水乙mi沉淀肽并凍干過夜。
圖3：THR-123
使用CEM Liberty Blue自動微波肽合成儀在0.556g Cl-MPA ProTide LL樹脂（離子交換容量：0.18 meq/g）上以0.10mmol規(guī)模合成肽（圖4），以0.05 mmol規(guī)模進行二硫化物形成。用10%哌qin在1:9乙醇/NMP 中的溶液進行脫保護。偶聯(lián)反應(yīng)在5倍過量的0.2M Fmoc-AA與1.0M DIC和1.0M Oxyma Pure在DMF中進行(CarboMAX)8。Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH用于半guang氨suanC。溶液DCM中2%TFA用于去保護Cys(Mmt)基團。使用25mM NCS在DMF中的溶液形成二硫化物。使用具有95:2.5:2.5 TFA/H2O/TIS的CEM Razor高通量肽切割系統(tǒng)進行切割。裂解后，用無水乙mi沉淀肽并凍干過夜。
圖4：CHEC-7
多肽合成：Conotoxin-SI, ICCNPACGPKYSC-NH2
使用CEM Liberty Blue自動微波肽合成儀在0.526g Rink Amide ProTide LL樹脂（離子交換容量：0.19 meq/g）上以0.10mmol規(guī)模合成肽（圖5）（以0.05mmol規(guī)模進行二硫化物形成）。用20%哌啶和0.1M Oxyma Pure的DMF溶液進行脫保護。偶聯(lián)反應(yīng)在5倍過量的0.2M Fmoc-AA與1.0M DIC和1.0M Oxyma Pure的DMF(CarboMAX)8中進行。Fmoc-(S)Cys(Mmt)-OH用于C，F(xiàn)moc-(S)-Cys(STmp)-OH用于半guang氨suanC。5% DTT和0.1M的NMM的DMF溶液用于去保護Cys(STmp)基團。使用25mM NCS在DMF中的溶液形成第一個二硫化物。2% TFA在DCM中的溶液用于去保護Cys(Mmt)。使用相同的NCS在DMF中的溶液形成第二個二硫鍵。使用具有95:2.5:2.5 TFA/H2O/TIS的CEM Razor高通量肽切割系統(tǒng)進行切割。裂解后，用無水乙mi沉淀肽并凍干過夜。
圖5：Conotoxin-SI
在配備有PDA檢測器的Waters Acquity UPLC系統(tǒng)上分析肽，該檢測器配備Acquity UPLC BEH C8柱（1.7mm和2.1x100mm）。UPLC系統(tǒng)連接到Waters 3100 Single Quad MS用于結(jié)構(gòu)測定。在Waters MassLynx軟件上進行峰分析。使用0.05% TFA的(i)H2O和(ii)MeCN溶液梯度洗脫進行分離。
結(jié)果
Liberty Blue自動微波肽合成儀上使用微波增強SPPS產(chǎn)合成催產(chǎn)素，產(chǎn)生了純度為69%的目標(biāo)肽（圖6）。
圖6：催產(chǎn)素的UPLC色譜圖
在Liberty Blue自動微波肽合成儀上使用微波增強SPPS合成THR-123，產(chǎn)生了純度為77%的目標(biāo)肽（圖7）。
圖7：THR-123的UPLC 色譜圖
在Liberty Blue自動微波肽合成儀上使用微波增強SPPS合成CHEC-7，產(chǎn)生了80%純度的目標(biāo)肽（圖8）。注意：5.72 min（參見圖9）和5.85min（參見圖10）處的峰均具有目標(biāo)肽質(zhì)量，不是差向異構(gòu)化的結(jié)果。
圖8：CHEC-7 的UPLC色譜圖
圖9：保留時間為5.72分鐘的峰質(zhì)譜圖
圖10：保留時間為5.85 分鐘的峰質(zhì)譜圖
Liberty Blue自動微波肽合成儀上使用微波增強SPPS合成芋螺毒素-SI，產(chǎn)生了純度為67%的目標(biāo)肽（圖11）。
圖11 ：Conotoxin-SI 的UPLC色譜圖
結(jié)論
使用自動微波增強多肽固相合成（SPPS）可以快速有效地合成二硫鍵橋接環(huán)肽。催產(chǎn)素的常規(guī)室溫合成需要超過13小時才能生成二硫鍵橋接肽7。使用微波增強SPPS，該肽在3小時內(nèi)合成，純度為69%。在3小時內(nèi)以高純度（分別為77%和80%產(chǎn)率）快速合成了具有C末端酸的環(huán)狀二硫鍵橋肽THR-123和CHEC-7。含有兩個二硫鍵的芋螺毒素-SI的常規(guī)室溫合成需要20小時7。另一方面，微波增強的SPPS可在4小時內(nèi)提供純度為67%的肽。
參考文獻
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[7]Postma, T. M.; Albericio, F. Org. Lett. 2013, 15 (3), 616–619.
[8]CEM Application Note (AP0124) - “CarboMAX - Enhanced Peptide Coupling at Elevated Temperature”.
[9]CEM Technical Note (P/N: 600837) - “Cl-MPA ProTide and Cl-TCP(Cl) ProTide Resin Loading and Protected Cleavage Procedures”.
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